Микробиологични, молекулярно-генетични и епидемиологични проучвания върху клинични щамове STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE изолирани за периода 2006 – 2013г.
Зареждане...
Дата
2015-01-24
Автори
Александрова, Александра Сашова // Alexandrova, Alexandra Sashova
Заглавие на списанието
ISSN на списанието
Заглавие на тома
Издател
Резюме
ЦЕЛ И ЗАДАЧИ
Цел на настоящата дисертация е:
Да се изследва разпространението на резистентни клинични изолати S.pneumoniae сред пациенти с инвазивни и респираторни пневмококови инфекции за периода 2006-2013г., да се проучи серотиповото разпределение и да се анализират молекулярните механизми свързани с макролидната рeзистентност и генетичната структура и клонално сходство на изследваните резистентни щамове.
За постигането на тази цел си поставихме следните задачи:
1. Да се определи in vitro чувствителността на инвазивни и неинвазивни клинични изолати S.pneumoniae към АМЛС, използвани за лечение на пневмококовите инфекции чрез метода определяне на минималните подтискащи концентрации.
2. Да се определи честотата в разпространението на Penicillin-нечувствителните, макролид-резистентните и множествено-резистентните щамове, да се актуализират данните и да се анализират тенденциите в развитието на антимикробната резистентност при щамове S.pneumoniae.
3. Да се определи фенотипа на Erythromycin-резистентните пневмококи.
4. Да се направи серотипова характеристика на изследваните щамове S.pneumoniae и да се изчисли процента участие на ваксиналните серотипове от пневмококовите конюгирани ваксини (потенциалната ефикасност на PCV).
5. Да се определят генетичните детерминанти отговорни за макролидна резистентност при S.pneumoniae с PCR и да се диференцират подкласовете резистентни гени с RFLP и директно автоматично секвениране.
6. Да се проучи клоналният произход сред представителна сбирка от пневмококови щамове с еднакъв резистотип и серотип чрез молекулярно-генетичните методи за епидемиологично типиране PFGE и MLST. 5
7. Да се направи анализ на клоналните и филогенетични връзки между проучваните щамове за последните осем години с данните публикувани от други страни.
МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ
Раздел I. Микробиологични изследвания:
1. Изследвани щамове S. рneumoniaе. В изследването са включени 591 щама S.pneumoniae, събрани за периода от 2006 г. до 2013 г. от централните микробиологични лаборатории на четири университетски болници в страната, НЦЗПБ, както и от микробиологични лаборатории в София. Разпределението на клиничните материали по градове е както следва: София – (n=318), Пловдив – (n=107), Плевен – (n=129), Варна - (n=37) клинични материали.
2. Микробиологични методи за идентификация на S. pneumoniae:
2.1.Тест с оптохин.
2.2.Тест за разтворимост в жлъчни соли.
3. Изпитване на чувствителност към антибиотици и определяне на МИК:
3.1. Дисково-дифузионен метод (ДДМ) според инструкциите на CLSI (M100-S23, 2013).
3.2. Определяне на МИК c микробульонен метод.
3.3.Определяне на МИК с метод на серийните разреждания на антибиотиците в агар.
3.4.Определяне на МИК c градиентен тест за антибиотична чувствителност (Е тест).
4. Фенотипни методи за проучване на механизмите на резистентност към макролидни антибиотици.
4.1. Фенотип на макролидна резистентност по троен дисков метод (Montanari et all., 2001г.).
5. Серотипиране:
5.1. Метод на Hойфелд за набъбване на капсулата.
5.2. Латекс-аглутинация.
//
SUMMARY
Objectives: A total of 591 invasive and respiratory clinical strains S.pneumoniae isolated during 2006-2013 from medical centers in Sofia, Plovdiv, Pleven and Varna were studied to evaluate the current levels of antimicrobial resistance, macrolide resistance mechanisms, pneumococcal serotype and sequence type (ST) distribution and population genetic structure. Results: According to the criteria of the CLSI (M100-S23, 2013), 313 (53.0%) of the studied strains were Penicillin-nonsusceptible. Macrolide resistance was observed in 40.4% of the pneumococcal strains. Multidrug resistance strains (resistant to three or more classes AB) were almost half of the studied pneumococci - 46.7%. The most spread serotypes in PRSP were: 19F (33.8%), 6B (13.2%), 23F (13.2%), 9V (10.6%), 19A (10.3%) and 14 (9.6%), which represented 90.7% of all PRSP. The most predominant serotypes in ERSP were: 19F (44.3%), 6B (21.0%), 14 (12.1%), 19A (10.9%), 6A (5.0%) and 23F (3.3%), which were 96.6% of all ERSP. The serotype coverage of PCV7, PCV10 and PCV13 for invasive pneumococcal strains of all ages patients for the prevaccinal-period (2006-2010) was 46.4%, 67.8% and 84.5%, respectively, and confirmed the requirement for a broader spectrum PCV in Bulgaria. The potential serotype coverage of PCV7, PCV10 and PCV13 for all clinical strains of the prevaccinal-period (2006-2010) for children up to 5 years (target group for vaccination) was 72.5%, 74.8% and 89.7%, respectively. For the post-vaccinal period (2011-2013) the potencial serotype coverage of PCV7, PCV10 and PCV13 in children up to 5 years was 62.1%, 64.9% and 94.6%, respectively. The predominant macrolide resistance gene was erm(B) – (n=135,56.5%) of all ERSP. A total of 70 (29.3%) isolates carried mef(E) gene, whereas (n=34, 14.2%) harbored both erm(B) and mef(E) genes. RFLP analysis and direct automated sequencing of mef amplicon in all mef-positive pneumococcal strains verified a subclass mef(E). Before the introduction of mandatory immunization in Bulgaria, serotype 19A was already significantly represented - 7.9%. This serotype was presented in all age groups, the strains were highly resistant and from various clinical sources. Global spread of this multi-resistant serotype after the introduction of PCV7 contributed the investigation of clonal structure of strains 19A in our country. The analysis of genomic DNA with PFGE revealed 13 different restriction patterns (A-M) among all 19A pneumococcal strains. The results from MLST showed presence of 15 ST among 19A researched strains. The most prevalent genotype (63.5%) among 19A pneumococcal strains was the multidrug-resistant clonal complex CC230, which is a capsular switched variant of the Denmark14-32 (ST230) global clone. The remaining 36.5% of 19A strains belonged to six genetically diverse CCs and two ST did not belong to known PMEN-clone, but to a known eBURST group. Five clones of serotype 19A S.pneumoniae were distributed globally and three of them were found in Bulgarian strains. Conclusion: The current research of antimicrobial resistance, serotype distribution and genetic structure of pneumococcal strains is giving the basis for future monitoring the evolution and genetic relatedness of Bulgarian S.pneumoniae strains with the global spread resistant clones.
Описание
Дисертационен труд за присъждане на
образователна и научна степен „Доктор”
Научна специалност: 01.06.12. Микробиология
Научен ръководител: Проф. д-р Лена Петрова Сечанова, д.м.
Научно жури: Проф. д-р Ива Стефанова Христова, д.м. Проф. д-р Людмила Боянова Георгиева, д.м.н. Проф. д-р Лена Петрова Сечанова, д.м. Проф. д-р Тодор Веселов Кантарджиев, д.м.н. Проф. д-р Енчо Запрянов Савов, д.м.н.
София
Ключови думи
стрептококус пневмоние; генетика; епидемиология; антибиотична резистентност; мултилокусно секвениране; полимеразна верижна реакция // , streptococcus pneumoniae, genetics; epidemiology; antibiotic resistance; multi locus sequence typing, polymerase chain reaction