Разработване и оценка на NGS технологии, приложими в клиничната практика
thumbnail.default.placeholder
Дата
2018-04-30
Автори
Павлов/Pavlov, Иван Юриев/Ivan Yuriev
Заглавие на списанието
ISSN на списанието
Заглавие на тома
Издател
Резюме
OБОБЩЕНИЕ *****
В настоящия дисертационен труд за първи път в нашата страна направихме оценка на възможностите на NGS технологията в две основни направления на молекулярно-биологичната диагностика: определяне на соматични мутации с диагностично значение при МН и определяне на полиморфизма при мултигенната и силно полиморфната HLA система. В първия случай от съществено значение е разработването на надежден метод с добра чувствителност, позволяваща определяне на ниски нива на мутантен алел. Във втория случай е важно достатъчно надеждно разграничаване на отделните алелни варианти, характеризиращи се с висока секвенционна хомология.
В настоящата работа разработихме и въведохме собствен 9-генен панел за NGS секвениране на соматични мутации, асоциирани с миелоидните неоплазми. В панела се включват 212 ампликона, които покриват всички кодиращи региони на гените ASXL1, EZH2, CALR, RUNX1, SETBP1, SF3B1, SRSF2, TET2, и U2AF1. Мутациите в тези гени са описани като диагностични и прогностични при МН. Чрез новоразработения NGS метод установихме 14 клинично значими кодиращи мутации в 6 от гените в панела. Откритите мутации в гените SRSF2 и CALR бяха потвърдени чрез PCR-SBТ. В две от изледваните проби се откриха 3 нови мутации в гените ТЕТ2 и U2AF1, които бяха потвърдени чрез цялостно екзомно секвениране. Резултатите от изпитването на NGS панела позволи да се разшири генетичния профил на изследваните пациенти. В 3 случая на МДС, ХММЛ и ЕТ, при които до този момент не бяха установени мутации в най-честите клонални маркери, се откриха мутации в гените RUNX1, CALR, TET2, SRSF2 и U2AF1. Методът показа по-висока чувствителност в сравнение с класическото Sanger секвениране, достигайки клинично значимия праг на детекция от 1% мутантен алел и има потенциала да достигне още по-висока чувствителност. Най-голямото предимство на въведения от нас NGS метод е възможността за едновременна детекция на мутации в много гени при голям брой проби. Новият NGS панел може да бъде използван в диагностичния подход при МПН като допълнителен метод след първоначален скрининг за водещи соматични мутации в гените JAK2, MPL и CALR.
В дисертационния труд е въведен PCR-SBT метод, чрез който за първи път в България се проведе изследване на честотата на SRSF2 и CALR мутации при пациенти с миелоидни неоплазми. Установените честоти за мутации в двата гена са сходни с доклади за други популации и потвърждават за водещата ролята на CALR в патогенезата на МПН, докато честота на SRSF2 мутации в тази група е много по-ниска. Това предполага включване на други субклонални мутации като потенциални маркери при MПН пациентите. Ролята на CALR мутациите е оценена спрямо водещите мутации в JAK2 и МPL. Статистическият анализ не показа сигнификантни различия в хематологичните показатели между пациенти с мутации в CALR и пациенти с JAK2 и MPL мутации. SRSF2 мутации се откриват най-често в случаите на MДС и МПН/МДС.
За да оценим клиничното приложение на NGS в генотипизирането на HLA при TХСК въведохме три NGS метода, използвайки секвенционните панели на Illumina (TruSight HLA), Omixon (Holotype HLA) и One Lambda (NXType). Трите метода са оценени на базата на работния процес и общото технологично време, основните качествени параметри на анализа и честотата на неразграничми алелни комбинации. Методът на Оmixon e най-кратък, лесноизпълним и се характеризира с най-малка вариация, респ. най-голяма стабилност на качествените показатели на анализа, както и най-малка честота на неразграничими алелни комбинации. Софтуерната програма на за анализ на Omixon - HLA Twin е също най-информативна, включвайки най-много качествени показатели. Оne Lambda NXType сe характеризира с най-дългия и трудоемък работен процес, но общото технологично време е по-кратко в сравнение с останалите методи. Това прави секвенционният панел NXType по-приложим в трансплантационни ситуации, при които е необходимо спешно провеждане на изследването. От друга страна методите на Illumina и Оmixon могат да бъдат приложени в HLA типизране при донорските регистри, където не се налага такава спешност. Проведеното чрез трите NGS метода типизиране не показа различия в HLA генотипите в сравнение с тези получени от PCR-SBT. NGS технологията показа ограничение в генотипизирането на HLA-DPB1, при което се установи висока честота на неразграничими алелни комбинации. Те произхождат от това, че секвенцията на дългия интрон 1 не се покрива адекватно и от трите секвенционни панела, което води до загуба във фазата на полиморфните секвенции и до невъзможност за определяне на цис и транс разположението им. Това ограничение на NGS се дължи на ограничената дължина на фрагментите и може да бъде преодоляно при платформите от трето поколение секвениране, при които се извършва секвениране на единични молекули. Получените резултати показват, че въведените oт нас NGS методи за HLA генотипизиране могат успешно да се приложат в клиничната лаборатория за определяне на тъканна съвместимост между реципиент и донор при TХСК и превъзхождат стандартния PCR-SBT метод като предоставят възможност за едностъпален процес на HLA типизиране с висока разграничителна способност.
Описание
Дисертационен труд за присъждане на образователна и научна степен „Доктор“
Докторска програма „Имунология“
София, 2017
Ключови думи
Генни мутации; ДНК-секвениране; Миелоидни неоплазми - диагностикаNGS (Next-Generation Sequencing) , Mutations; DNA sequencing; NGS (Next-Generation Sequencing); Myeloid neoplasms - diagnosis